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荧光显微镜与普通光学显微镜区别及特性

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荧光显微镜与普通光学显微镜不同,它不是通过普通光源的照明观察标本,而是利用定波长的光(通常是紫外光、蓝紫光)激发显微镜下标本内的荧光物质,使之发射荧光,所以,荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明,而是作为种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本,不是由于光源的照明,而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。由此可知,荧光显微镜的特点,主要是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光,使受检标本内的荧光物质能获得必要强度的激发光。同时,荧光显微镜必须具备相应的滤光镜系统。荧光显微镜是**荧光组织化学的基本工具。它是由超压光源、滤片系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和摄影系统等主要部件组成,是利用定波长的光激发标本发射荧光。


荧光显微镜.png



1.激发荧光的方式:按光的波长范围分为UV激发法(使用紫外线照明法)BV激发法(使用蓝紫光)两种。UV激发法是用短于400nm的近紫外光进行激发。该法不存在可见的激发光,所以被观察的荧光呈现该染料固有的荧光,容易判别标本上的特异荧光和背景组织的自身荧光。

 

2.BV激发法:是以404nm、434nm为中心的由紫外至蓝光进行激发。该方法使用蓝光照射标本,所以荧光观察系统的截止滤光片必须使用可完全阻断蓝光并可充分通过所需绿、黄荧光的滤光片。用于荧光抗体法的荧光色素。对于激发光的大吸收波长和荧光的大发光波长比较接近,所以BV激发法使用的滤光片必须使用锐截止式滤光片。该法可用蓝光作为激发光,所以荧光色素的吸收效率较,可得到较明亮的图像。其缺点是500nm以下的荧光无法看到,而500nm以上的使整个图像显黄色。在荧光抗体法中,大多以荧光色素特有的颜色来判断其特异性,所以在讨论微妙的特异性时,上述BV激发法的缺点往往影响大。

 

 荧光显微镜与普通光学显微镜光源的区别

 荧光显微镜的光源主要采用氙弧灯或汞灯,但近年来也使用高功率LED作光源,而普通光学显微镜通常只有卤素或LED灯来照明。荧光显微镜的照明方式一般是用落射式,也就是说光源是通过物镜来投放于试验样本上,而普通光学显微镜是直接用光源照射样品,从而进行的观察。在分辨率上讲,荧光显微镜利用的是紫外线光源,波长比较短,但是分辨率却高于普通的光学显微镜。在滤光片的使用上,荧光显微镜是用了两个特殊的滤光片,在光源前的作用是用来滤出可见光,在物镜和目镜之间的作用是用来滤出紫外线,以保护观察者的眼睛。荧光显微镜与普通光学显微镜的区别大致就是这些。

 

荧光显微镜工作原理

多采用200W的超高压汞灯作光源,它是用石英玻璃制作,中间呈球形,内充一定数量的汞,工作时由两个电极间放电,引起水银蒸发,球内气压迅速升高,当水银完全蒸发时,可达5070个标准大气压力,这一过程一般约需515min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光,足以激发各类荧光物质,因此,为荧光显微镜普遍采用。

1.激发滤板根据光源和荧光色素的特点,可选用以下三类激发滤板,提供一定波长范围的激发光。

 紫外光激发滤板:此滤板可使400nm以下的紫外光透过,阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1UG-5,外加一块BG-38,以除去红色尾波。

紫外蓝光激发滤板:此滤板可使300450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2ZB-3,外加BG-38

紫蓝光激发滤板:它可使350490nm的光通过。常用型号为QB24BG12)。

 最大吸收峰在500nm以上者的荧光素(如罗达明色素)可用蓝绿滤板(如B-7)激发。


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